研究背景

化療后Tumors復(fù)發(fā)的一個(gè)潛在原因是存在診療前耐藥的亞群，靶向診療確定誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的亞群可能會(huì)改善Tumors診療。2023年6月，達(dá)納法伯研究所的Anthony Letai團(tuán)隊(duì)與Patrick D. Bhola團(tuán)隊(duì)合作，在Science Advances（IF=11.7)雜志上發(fā)表了一篇題為“Sequential apoptotic and multiplexed proteomic evaluation of single cancer cells”的研究論文。該研究聚焦于單個(gè)Tumors細(xì)胞的順序凋亡過程以及多重蛋白質(zhì)組學(xué)評價(jià)。

研究路線

研究方法

RT-BH3:本研究開發(fā)并驗(yàn)證了一種實(shí)時(shí)BH3分析技術(shù)，檢測細(xì)胞暴露于合成BH3肽后引起的線粒體外膜通透性（MOMP）變化。能夠在細(xì)胞死亡的早期階段（即細(xì)胞凋亡酶和核酸酶激發(fā)之前）進(jìn)行測量。為了測量活細(xì)胞的MOMP，研究人員使用了陽離子染料四甲基羅丹明乙酯(TMRE)，測量了在MOMP之后發(fā)生的跨線粒體內(nèi)膜的電位損失。

CycIF:在相同的單細(xì)胞上，研究人員還進(jìn)行了循環(huán)免疫熒光檢測（CycIF）。從而更準(zhǔn)確地了解細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)。該技術(shù)能夠在同一細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)對30多種蛋白質(zhì)的多重免疫熒光分析。將常見熒光標(biāo)記物與抗體結(jié)合，通過連續(xù)的4~6 通道組織成像獲得相應(yīng)蛋白標(biāo)志物的成像圖。并通過標(biāo)記-淬滅-再標(biāo)記的循環(huán)免疫熒光法構(gòu)建連續(xù)熒光成像，在同一細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)多種蛋白標(biāo)志物的檢測。與抗體標(biāo)記剝離方法不同， CycIF 的反應(yīng)條件較溫和且易于標(biāo)準(zhǔn)化。然而，該方法存在熒光團(tuán)失活、信號(hào)不足、染色不均勻以及細(xì)胞易丟失等問題。

顛覆傳統(tǒng)，空間色彩賦能疾病研究-弗瑞思全新推出超多標(biāo)技術(shù)

近幾年，以TSA技術(shù)為主的多色免疫熒光，對復(fù)雜組織微環(huán)境研究觀察多個(gè)蛋白的共表達(dá)以及空間特征分布有了更深入的了解。隨著深入的研究，對單張切片能共染的靶標(biāo)數(shù)量要求越來越多，單一的間接熒光標(biāo)記法、直接標(biāo)記法、TSA酪氨信號(hào)放大技術(shù)已經(jīng)不能滿足部分科研工作者的需求，以其他標(biāo)記方式實(shí)現(xiàn)的超多標(biāo)技術(shù)，受限因素較多、受益者有限。

弗瑞思病理25年新產(chǎn)品超多色免疫熒光技術(shù)，介于TSA多色免疫熒光技術(shù)和超多標(biāo)循環(huán)染色技術(shù)靶標(biāo)數(shù)目中間，單張切片能標(biāo)記7-12個(gè)Marker，個(gè)性化隨意組合，減少串色風(fēng)險(xiǎn)，全景成像無限縮放，識(shí)別更多細(xì)胞表型及空間特征，更容易發(fā)現(xiàn)復(fù)雜組織微環(huán)境新亮點(diǎn)。還有以HALO圖像分析平臺(tái)+自主研發(fā)國產(chǎn)圖像分析平臺(tái)為主的數(shù)據(jù)個(gè)性化平臺(tái)，與多種臨床數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，為疾病的機(jī)制研究及診療預(yù)后尋找新突破。

研究結(jié)果

為了定量分析單細(xì)胞中TMRE的喪失，研究人員開發(fā)了一個(gè)分析流程，發(fā)現(xiàn)在幾種合成BH3肽濃度下，細(xì)胞之間凋亡啟動(dòng)狀態(tài)存在差異。

接下來，研究人員試圖確定在Tumors細(xì)胞系中是否存在與凋亡啟動(dòng)相關(guān)的蛋白測量。他們首先在HeLa細(xì)胞上用合成的BIM肽進(jìn)行RT-BP。隨后使用一組抗體進(jìn)行7個(gè)循環(huán)的Cy CIF。該組抗體包括Bcl-2家族蛋白、細(xì)胞周期標(biāo)記物、EMT轉(zhuǎn)化標(biāo)記物和DNA損傷標(biāo)記物。

為了將凋亡啟動(dòng)與多重免疫熒光聯(lián)系起來，他們根據(jù)細(xì)胞的地理坐標(biāo)，將凋亡啟動(dòng)的測量與CyCIF七個(gè)周期的蛋白強(qiáng)度聯(lián)系起來。對于單細(xì)胞系，研究人員還評估了單細(xì)胞凋亡啟動(dòng)與免疫熒光染色之間的單變量皮爾森相關(guān)系數(shù)。發(fā)現(xiàn)合成的BIM肽段對3種細(xì)胞系均能誘導(dǎo)與預(yù)激發(fā)相關(guān)的Bak蛋白表達(dá)。在針對特定合成BH3肽的單細(xì)胞系中，他們可以發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞相關(guān)的預(yù)激發(fā)。

研究人員繼續(xù)研究結(jié)腸患者來源的異種移植（PDX）模型中凋亡啟動(dòng)的異質(zhì)性，他們首先關(guān)注了COCA235 PDX模型中單個(gè)Bcl-2家族蛋白與凋亡啟動(dòng)之間的相關(guān)性。他們發(fā)現(xiàn)，凋亡啟動(dòng)與抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。此外，他們還對6個(gè)PDX模型中的所有單個(gè)蛋白進(jìn)行了啟動(dòng)狀態(tài)與免疫熒光表達(dá)之間的單變量皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析。值得注意的是，在這6個(gè)PDX模型中，有4個(gè)模型顯示出凋亡啟動(dòng)與促凋亡蛋白Bak之間存在明顯的正相關(guān)性。這一發(fā)現(xiàn)揭示了Bak蛋白在這些模型中對凋亡啟動(dòng)的重要作用，同時(shí)也突顯了PDX模型在研究腫瘤細(xì)胞凋亡異質(zhì)性方面的價(jià)值。

為了定性識(shí)別啟動(dòng)不良亞群的多變量特征，研究人員建立的數(shù)學(xué)模型能夠基于蛋白質(zhì)表達(dá)水平預(yù)測細(xì)胞的凋亡敏感性。研究人員首先基于循環(huán)免疫熒光和單細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的疊加，為每個(gè)結(jié)腸PDX模型生成了t-SNE圖。例如在COCA235 PDX模型中，他們識(shí)別出兩個(gè)相對啟動(dòng)不良的細(xì)胞亞群，這些亞群的凋亡啟動(dòng)水平低于所有細(xì)胞的平均值。

為了進(jìn)一步識(shí)別高啟動(dòng)或低啟動(dòng)亞群的特征，研究人員量化了這些亞群相對于整個(gè)群體的蛋白表達(dá)水平。在COCA235 PDX模型中，兩個(gè)啟動(dòng)不良的亞群表現(xiàn)出較高的抗凋亡蛋白Mcl-1水平和較低的波形蛋白水平；而在COCA39模型中，兩個(gè)啟動(dòng)不良的亞群相對于整個(gè)人群的平均Her2表達(dá)水平，展現(xiàn)出了更高的Her2表達(dá)水平。

總結(jié)

 綜上所述，本研究通過實(shí)時(shí)BH3分析和循環(huán)免疫熒光檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)能夠在單細(xì)胞水平上識(shí)別出對凋亡敏感性不同的亞群。并且這些亞群的特征與特定的蛋白質(zhì)表達(dá)模式相關(guān)。并建立了數(shù)學(xué)模型來預(yù)測細(xì)胞的凋亡敏感性。這些模型不僅能夠識(shí)別與凋亡敏感性相關(guān)的蛋白質(zhì)，還能夠揭示不同蛋白質(zhì)之間的相互作用對凋亡敏感性的影響。

這項(xiàng)研究提供了一種新的技術(shù)手段，用于在單細(xì)胞水平上評估Tumors細(xì)胞對凋亡的敏感性，并識(shí)別出對診療耐藥的細(xì)胞亞群的特征。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于開發(fā)針對耐藥細(xì)胞亞群的個(gè)性化診療策略，提高Tumors診療的效果。