免疫藍圖中淋巴細胞網(wǎng)絡(luò)是動態(tài)的細胞群

弗瑞思文獻解讀，分享科研消息，解讀前沿科研內(nèi)容。

2024-11-07 09:02:41南京弗瑞思生物科技有限公司1

本文亮點：

1.多重免疫熒光揭示肺腺癌KP（Kras/Trp53）GEMM小鼠模型中淋巴細胞網(wǎng)的相互作用；

2.小淋巴網(wǎng)以T細胞為主，B細胞比例隨著淋巴網(wǎng)擴大而增加；

3.淋巴網(wǎng)的關(guān)鍵特征是他們含有TCF1+ PD- 1+ CD8+細胞的祖細胞；

4.免疫治療后淋巴細胞獲得細胞毒性CD8+ T細胞。

多色免疫熒光應(yīng)用（CyCIF） :

24個蛋白循環(huán)染色：B220 ；CD45；FOXP3；CD4；CD8a；CD103；CD11c；CD11b；Nkp46；CD3e；Ki-67；PD-L1；PD-1；Granzyme B；Perforin；TIM3；Ly6G；TCF1；Vimentin；aSMA；F4/80；Pan-Keratin；PCNA；TTF1。

01#

研究背景

BACKGROUND

在癌癥進展過程中，免疫細胞增殖、遷移和適應(yīng)以試圖阻止腫瘤擴散；腫瘤細胞通過誘導抑制免疫細胞功能的程序來應(yīng)答；因此，描述免疫細胞的功能狀態(tài)及其相對于腫瘤細胞的空間特征，以識別抗腫瘤免疫的特征尤為重要。本文通過Kras/ trp53突變（KP）肺腺癌模型，將慢病毒編碼的Cre重組酶導入Kras /Trp53小鼠。在KP模型的LucOS變體中，引入卵清蛋白的SIIN和合成肽SIY，兩種模型CD8+ T細胞抗原，KP-Cre與LucOS相比，LucOS小鼠顯示腫瘤中CD8+ T細胞的數(shù)量顯著增加。

雖然多種解離的單細胞方法可以深入了解模型動物中腫瘤發(fā)生和免疫監(jiān)視，但這些方法缺乏關(guān)于細胞間相互作用和細胞群位置的關(guān)系。常規(guī)病理實驗并不能提供精確的詳細分子信息。本研究作者使用多重免疫熒光技術(shù)來表征KP-LucOS中腫瘤-免疫相互作用的空間特征，包括當趨化因子介導的運輸被調(diào)節(jié)時，以及免疫治療后的空間特征。

02#

研究內(nèi)容

RESEARCH QUESTION

作者建立小鼠肺癌模型后并進行免疫治療；進行HE、CyCIF、RNAscope實驗，HE染色進行形態(tài)觀察和注釋，CyCIF染色鑒定多種細胞類型和進行后續(xù)空間特征分析，RNAscope從轉(zhuǎn)錄豐度上表征相關(guān)細胞因子的水平及相關(guān)性，基于多模態(tài)整合數(shù)據(jù)進行隊列分析，腫瘤特征分析，免疫特征空間分析等挖掘腫瘤微環(huán)境空間特征。

腫瘤抗原表達重組KP肺癌的免疫景觀:在KP Cre和KP LucOS中以8周為時間點，感染后8周HE及CyCIF展示LucOS小鼠的腫瘤負荷顯著低于Cre小鼠。當整個肺組織作為一個整體，LucOS小鼠中免疫細胞差異不明顯。劃分腫瘤區(qū)域后顯示髓樣細胞在腫瘤邊緣更豐富，但沒有浸潤到腫瘤中，LucOS模型中以與淋巴細胞相似的空間模式更容易浸潤到腫瘤內(nèi)。

抗原表達與淋巴細胞網(wǎng)絡(luò)是否存在腫瘤內(nèi)定位相關(guān)：在Cre和LucOS小鼠中，B、T細胞的比例與淋巴結(jié)大小呈相關(guān)性；小淋巴網(wǎng)T細胞多，大淋巴網(wǎng)B細胞增加并呈線性上升；說明以T細胞為核心隨后招募B細胞生長。LucOS淋巴網(wǎng)中Treg減少細胞毒性T細胞增加。熱圖顯示在Cre小鼠中，大多數(shù)淋巴細胞位于腫瘤外部，而在LucOS肺中，大多數(shù)淋巴細胞位于腫瘤內(nèi)部。這些發(fā)現(xiàn)揭示了T細胞抗原表達可能與抑制腫瘤生長有關(guān)。

CXCR3配體調(diào)節(jié)淋巴網(wǎng)形成和大小，但不調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)定位：CyCIF 和 RNAScope連續(xù)切片染色結(jié)果顯示，與Cre小鼠相比，LucOS小鼠肺組織中Cxcl 9和Cxcl 10 mRNA水平適度增加，B和T細胞更靠近LucOS小鼠中的Cxcl 9和CxcllO陽性細胞，而且免疫群體主要存在于淋巴網(wǎng)內(nèi)。淋巴細胞屬于淋巴網(wǎng)的可能性與到最近的Cxcl 9或CxcllO陽性細胞的距離負相關(guān)。

空間分析揭示了免疫治療后TC細胞狀態(tài)的動態(tài)變化：作者建立了2種免疫細胞治療（Vax和ICB）的模型，利用多維表達數(shù)據(jù)模擬單細胞分化軌跡，用6個Marker標記細胞毒性T細胞分為3個不同的狀態(tài)（S1狀態(tài)對應(yīng)于初始T細胞狀態(tài)；S2代表增殖性細胞毒性T細胞狀態(tài)。S3代表耗竭的T細胞狀態(tài)。），隨后分析在腫瘤中的位置：Vax小鼠S2 A狀態(tài)在腫瘤遠端發(fā)現(xiàn)，S2 B（Vax）和S2（ICB）狀態(tài)在腫瘤內(nèi)富集，S3群體被發(fā)現(xiàn)靠近腫瘤邊緣。Vax和ICB治療均未顯著改變過渡表型的CD8+ T細胞。在Vax中，T2細胞在腫瘤內(nèi)富集，并且富集共表達TCFl和PD-I的細胞?？傊?，TCF1+ PD-1+祖細胞CD8+ T細胞富集在特定的過渡狀態(tài)，可有效地轉(zhuǎn)移到腫瘤中并駐留。

TCF1+ PD-1+CD8+ T祖細胞位于腫瘤淋巴網(wǎng)內(nèi)：作者又分析了淋巴細胞中T細胞不同亞型占比及富集分析，淋巴細胞中Tc細胞的總數(shù)與TCF1+ PD-1+細胞的數(shù)量線性相關(guān)；淋巴細胞的Tc區(qū)室也主要由含有TCF1+PD-1+祖細胞的過渡T2狀態(tài)組成。免疫治療后，具有細胞毒性潛能的細胞與TCF 1+PD-1+祖細胞共定位在淋巴網(wǎng)中。最后作者推測一個模型：Tc細胞在從TCF1+S1狀態(tài)分化成T2 TCF1+PD-1+狀態(tài)時迀移到腫瘤內(nèi)淋巴網(wǎng)中；ICB和Vax免疫療法促進TCF1+PD-1+細胞在腫瘤內(nèi)分化為細胞毒性S2 B狀態(tài)，然后這些細胞在抑制性受體上調(diào)和細胞毒性活性下調(diào)后進展為T細胞耗竭S3狀態(tài)。

TCF1+ PD-1+CD8+ T祖細胞富集的淋巴網(wǎng)在早期人類肺腺癌中富集：作者最后又檢測了14例早期人肺腺癌患者的樣本進行對比。人腫瘤中的淋巴網(wǎng)同小鼠類似大多數(shù)是小的淋巴網(wǎng)，T細胞逐漸下降B細胞逐漸增加，這些發(fā)現(xiàn)表明，早期人類和小鼠肺癌的抗癌免疫反應(yīng)的特征是小淋巴細胞網(wǎng)絡(luò)占優(yōu)勢。Tc細胞鑒定祖CD8+ T細胞的TCF 1和PD-1共表達群體時，Tc細胞存在于淋巴網(wǎng)的外部和內(nèi)部，但TCF1+ PD-1+祖細胞主要存在與淋巴網(wǎng)，并且隨著淋巴網(wǎng)尺寸增加而增加。

03#

結(jié)論

CONCIUDE

本研究在小鼠肺癌模型和人肺癌中出現(xiàn)的淋巴網(wǎng)的特征進行深入解析：淋巴網(wǎng)聚集的大小與T細胞/B細胞的數(shù)量及空間分布及發(fā)現(xiàn)TCF1+ PD-1+ CD8+T祖細胞位于腫瘤內(nèi)部對淋巴細胞抗腫瘤作用的全新詮釋，以更好的解釋淋巴網(wǎng)產(chǎn)生支持CD8+ T細胞抗腫瘤應(yīng)答的空間環(huán)境的分子機制。

摘要翻譯：

淋巴細胞是腫瘤免疫監(jiān)視的關(guān)鍵，但我們對促進淋巴細胞抗腫瘤功能的空間特征了解有限。作者使用多重免疫熒光技術(shù)、定量及空間分析和機器學習創(chuàng)建了Kras/ trp53突變小鼠模型和人類切除的肺部腫瘤的高清空間特征。相互作用的淋巴細胞網(wǎng)絡(luò)（“淋巴網(wǎng)”）作為抗癌免疫反應(yīng)的一個顯著特征。由小T細胞聚集成簇成核心，并隨著體積的增加B細胞增加。cxcr3介導的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)淋巴細胞的大小和數(shù)量，但T細胞抗原的表達指導腫瘤內(nèi)定位。淋巴細胞優(yōu)先攜帶參與免疫檢查點阻斷（ICB）治療應(yīng)答的TCF1+ PD-1+祖細胞CD8+ T細胞。在使用ICB或抗原靶向疫苗治療的小鼠中，淋巴細胞保留了祖細胞并獲得了細胞毒性CD8+ T細胞群，這可能是通過祖細胞分化實現(xiàn)的。這些數(shù)據(jù)表明，淋巴細胞創(chuàng)造了一個支持CD8+ T細胞抗腫瘤反應(yīng)的空間環(huán)境。