從保存抗原的角度來(lái)看, 冰凍切片比石蠟切片更有優(yōu)勢(shì), 因此用冰凍切片做免疫組化染色在科研或病理診斷上運(yùn)用也越來(lái)越常見, 但高質(zhì)量的免疫組化染色效果受很多因素的影響, 在此討論一些冰凍切片防冰晶的方法及注意事項(xiàng)。

組織離體后如不能盡快OCT包埋冰凍切片，組織快速冷凍放-80°冰箱備用，包埋時(shí)要盡量防止氣泡產(chǎn)生, 包埋時(shí)存在氣泡會(huì)造成包埋不均勻, 在切片時(shí)因氣泡與OCT膠質(zhì)地不同,所切的片子容易從氣泡周圍開始卷曲;包埋后須把OCT膠修成長(zhǎng)方形、正方形或是梯形, 保證所切的腦片周邊沒(méi)有小的尖刺, 切片周邊小的尖刺或切片形狀不規(guī)則都容易使切片從這些不規(guī)則的地方開始卷曲。

牢固固定樣品托, 雖然現(xiàn)在冰凍切片機(jī)結(jié)構(gòu)良好, 但是這個(gè)問(wèn)題容易被實(shí)驗(yàn)操作者忽視若樣品托固定不牢固或有轉(zhuǎn)動(dòng)的情況, 由于組織重力和刀片的相互作用會(huì)使切片成弧形而造成貼片不完全, 切片時(shí)要先慢后快, 先慢為使刀片切力小, 使組織片不容易卷曲, 后快為使所切的組織片遠(yuǎn)離刀片邊緣, 使得貼片容易。組織標(biāo)本盡量一次性切完, 因組織抗原通常是一種蛋白質(zhì),反復(fù)凍溶組織會(huì)損傷組織抗原;而且被反復(fù)凍融的組織會(huì)變脆甚至性狀發(fā)生改變, 從而使切片和貼片困難, 使組織更易出現(xiàn)脫片情況

可在載玻片上滴3μl左右的PBS后貼片, 以所滴的PBS為起點(diǎn)輕輕沾起組織片, 該過(guò)程要防止氣泡產(chǎn)生。

貼片完成后, 需室溫待載玻片上的PBS涼干后, 將切片放入-80℃冰箱中備用, 否則殘留的PBS會(huì)在玻片與腦片間結(jié)冰, 導(dǎo)致免疫組化過(guò)程中易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。剛剛切好的冰凍切片不宜馬上作免疫組化, 容易出現(xiàn)脫片, 可能是因?yàn)槊髂z這種蛋白質(zhì)與硫酸鉻鉀形成的膠狀混合物涂在載玻片上后, 再與富含脂肪的腦片黏合需要一定的時(shí)間,切片完成后放于-80℃冰箱2至3天后, 待腦片與玻片黏合充分后, 再做免疫組化則不易出現(xiàn)脫片。切片放置時(shí)間不宜超過(guò)一個(gè)月, 否則會(huì)影響冰凍切片上的抗原。

將新鮮組織迅速置于包埋托上, 再將組織的表面全部用進(jìn)口OCT膠包后放入低溫切片機(jī)內(nèi)冷凍5 min左右切片;

將新鮮取材的組織迅速置于10%~30%的蔗糖溶液中, 置4 ℃冰箱過(guò)夜, 待組織塊沉底后, 取出, PBS沖洗后用OCT膠包埋切片;

將組織塊置入低溫環(huán)境中, 使組織驟然降溫。本實(shí)驗(yàn)室采用的是液氮驟冷, 即將新鮮取材的組織迅速置于液氮罐內(nèi)10~30 s, 取出, OCT膠包埋后置于低溫切片機(jī)內(nèi)待其復(fù)溫至-20 ℃左右即可切片。

使用單純OCT膠包埋法鏡下觀察見較大、多的冰晶形成, 冰晶形成面積明顯高于低溫驟冷法及高滲透壓脫水法, 嚴(yán)重影響觀察結(jié)果的準(zhǔn)確性;高滲透壓脫水法則有較少、較小的冰晶形成, 冰晶形成面積高于低溫驟冷法;液氮驟冷法幾乎無(wú)冰晶形成。液氮驟冷是較好的防冰晶方法。不同的防冰晶方式為何會(huì)產(chǎn)生如此不同的結(jié)果, 這主要由冰晶產(chǎn)生的特點(diǎn)所決定。因?yàn)榻M織在恒冷箱切片機(jī)內(nèi)的冷凍過(guò)程中, 組織內(nèi)的水分子逐漸聚集形成冰晶。一旦冰晶的形成, 它們就逐漸膨脹, 并擠壓圍繞它們的細(xì)胞器。當(dāng)冰凍的組織切片在室溫晾置時(shí), 由于溫度高, 使冰晶融化, 在組織上留下許多孔狀的空隙,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的破壞甚至于酶和蛋白等微細(xì)結(jié)構(gòu)的移位, 以致于影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。水在-4 ℃時(shí)體積大, 這意味著組織在-4 ℃左右的低溫環(huán)境中停留時(shí)間越長(zhǎng), 組織內(nèi)所產(chǎn)生的冰晶的體積越大、數(shù)量越多, 即組織內(nèi)形成冰晶的數(shù)量與組織冷凍的速度成反比, 因此, 要盡量避免緩慢的冷卻, 使組織的溫度迅速降至-4 ℃以下;或者通過(guò)置換組織內(nèi)的水份也可以減少冰晶的形成。OCT膠即較好切片溫度溶液, 是一種多糖物質(zhì), 它既可以起到包埋支架的作用, 又可以置換組織內(nèi)的水分來(lái)減少冰晶的形成, 但它的置換效果遠(yuǎn)不及高張蔗糖明顯;高張蔗糖能以其較高的表面張力置換組織內(nèi)的水分以減少冰晶的產(chǎn)生, 但蔗糖的黏滯性常使切片粘于刀上,難以取下, 若輔以O(shè)CT膠包埋則可以切出很完整的切片;而液氮能在幾秒鐘內(nèi)將組織降至-195 ℃度的低溫, 盡可能地減少了冰晶的形成;但液氮因其低溫的冷凍常使較大的組織凍裂, 若將組織用OCT膠包埋后再置于液氮內(nèi), OCT膠在低溫下固化, 形成一固態(tài)的外殼防止組織斷裂, 保證了結(jié)構(gòu)的完整性。