免疫藍(lán)圖中淋巴細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是動(dòng)態(tài)的細(xì)胞群

弗瑞思文獻(xiàn)解讀，分享科研消息，解讀前沿科研內(nèi)容。

2024-11-07 09:02:41南京弗瑞思生物科技有限公司17

本文亮點(diǎn)：

1.多重免疫熒光揭示肺腺cancerKP（Kras/Trp53）GEMM小鼠模型中淋巴細(xì)胞網(wǎng)的相互作用；

2.小淋巴網(wǎng)以T細(xì)胞為主，B細(xì)胞比例隨著淋巴網(wǎng)擴(kuò)大而增加；

3.淋巴網(wǎng)的關(guān)鍵特征是他們含有TCF1+ PD- 1+ CD8+細(xì)胞的祖細(xì)胞；

4.免疫診療后淋巴細(xì)胞獲得細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞。

多色免疫熒光應(yīng)用（CyCIF） :

24個(gè)蛋白循環(huán)染色：B220 ；CD45；FOXP3；CD4；CD8a；CD103；CD11c；CD11b；Nkp46；CD3e；Ki-67；PD-L1；PD-1；Granzyme B；Perforin；TIM3；Ly6G；TCF1；Vimentin；aSMA；F4/80；Pan-Keratin；PCNA；TTF1。

01#研究背景

在cancer進(jìn)展過(guò)程中，免疫細(xì)胞增殖、遷移和適應(yīng)以試圖阻止Tumor擴(kuò)散；Tumor細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)抑制免疫細(xì)胞功能的程序來(lái)應(yīng)答；因此，描述免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)及其相對(duì)于Tumor細(xì)胞的空間特征，以識(shí)別抗Tumor免疫的特征尤為重要。本文通過(guò)Kras/ trp53突變（KP）肺腺cancer模型，將慢病毒編碼的Cre重組酶導(dǎo)入Kras /Trp53小鼠。在KP模型的LucOS變體中，引入卵清蛋白的SIIN和合成肽SIY，兩種模型CD8+ T細(xì)胞抗原，KP-Cre與LucOS相比，LucOS小鼠顯示Tumor中CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量有效增加。

雖然多種解離的單細(xì)胞方法可以深入了解模型動(dòng)物中Tumor發(fā)生和免疫監(jiān)視，但這些方法缺乏關(guān)于細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞群位置的關(guān)系。常規(guī)病理實(shí)驗(yàn)并不能提供精確的詳細(xì)分子信息。本研究作者使用多重免疫熒光技術(shù)來(lái)表征KP-LucOS中Tumor-免疫相互作用的空間特征，包括當(dāng)趨化因子介導(dǎo)的運(yùn)輸被調(diào)節(jié)時(shí)，以及免疫診療后的空間特征。

02#研究?jī)?nèi)容

作者建立小鼠肺cancer模型后并進(jìn)行免疫診療；進(jìn)行HE、CyCIF、RNAscope實(shí)驗(yàn)，HE染色進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察和注釋?zhuān)珻yCIF染色鑒定多種細(xì)胞類(lèi)型和進(jìn)行后續(xù)空間特征分析，RNAscope從轉(zhuǎn)錄豐度上表征相關(guān)細(xì)胞因子的水平及相關(guān)性，基于多模態(tài)整合數(shù)據(jù)進(jìn)行隊(duì)列分析，Tumor特征分析，免疫特征空間分析等挖掘Tumor微環(huán)境空間特征。

Tumor抗原表達(dá)重組KP肺cancer的免疫景觀(guān):在KP Cre和KP LucOS中以8周為時(shí)間點(diǎn)，被染后8周HE及CyCIF展示LucOS小鼠的Tumor負(fù)荷有效低于Cre小鼠。當(dāng)整個(gè)肺組織作為一個(gè)整體，LucOS小鼠中免疫細(xì)胞差異不明顯。劃分Tumor區(qū)域后顯示髓樣細(xì)胞在Tumor邊緣更豐富，但沒(méi)有浸潤(rùn)到Tumor中，LucOS模型中以與淋巴細(xì)胞相似的空間模式更容易浸潤(rùn)到Tumor內(nèi)。

抗原表達(dá)與淋巴細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是否存在Tumor內(nèi)定位相關(guān)：在Cre和LucOS小鼠中，B、T細(xì)胞的比例與淋巴結(jié)大小呈相關(guān)性；小淋巴網(wǎng)T細(xì)胞多，大淋巴網(wǎng)B細(xì)胞增加并呈線(xiàn)性上升；說(shuō)明以T細(xì)胞為主要隨后招募B細(xì)胞生長(zhǎng)。LucOS淋巴網(wǎng)中Treg減少細(xì)胞毒性T細(xì)胞增加。熱圖顯示在Cre小鼠中，大多數(shù)淋巴細(xì)胞位于Tumor外部，而在LucOS肺中，大多數(shù)淋巴細(xì)胞位于Tumor內(nèi)部。這些發(fā)現(xiàn)揭示了T細(xì)胞抗原表達(dá)可能與抑制Tumor生長(zhǎng)有關(guān)。

CXCR3配體調(diào)節(jié)淋巴網(wǎng)形成和大小，但不調(diào)節(jié)Tumor內(nèi)定位：CyCIF 和 RNAScope連續(xù)切片染色結(jié)果顯示，與Cre小鼠相比，LucOS小鼠肺組織中Cxcl 9和Cxcl 10 mRNA水平適度增加，B和T細(xì)胞更靠近LucOS小鼠中的Cxcl 9和CxcllO陽(yáng)性細(xì)胞，而且免疫群體主要存在于淋巴網(wǎng)內(nèi)。淋巴細(xì)胞屬于淋巴網(wǎng)的可能性與到近的Cxcl 9或CxcllO陽(yáng)性細(xì)胞的距離負(fù)相關(guān)。

空間分析揭示了免疫診療后TC細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化：作者建立了2種免疫細(xì)胞診療（Vax和ICB）的模型，利用多維表達(dá)數(shù)據(jù)模擬單細(xì)胞分化軌跡，用6個(gè)Marker標(biāo)記細(xì)胞毒性T細(xì)胞分為3個(gè)不同的狀態(tài)（S1狀態(tài)對(duì)應(yīng)于初始T細(xì)胞狀態(tài)；S2表示增殖性細(xì)胞毒性T細(xì)胞狀態(tài)。S3表示耗竭的T細(xì)胞狀態(tài)。），隨后分析在Tumor中的位置：Vax小鼠S2 A狀態(tài)在Tumor遠(yuǎn)端發(fā)現(xiàn)，S2 B（Vax）和S2（ICB）狀態(tài)在Tumor內(nèi)富集，S3群體被發(fā)現(xiàn)靠近Tumor邊緣。Vax和ICB診療均未有效改變過(guò)渡表型的CD8+ T細(xì)胞。在Vax中，T2細(xì)胞在Tumor內(nèi)富集，并且富集共表達(dá)TCFl和PD-I的細(xì)胞。總之，TCF1+ PD-1+祖細(xì)胞CD8+ T細(xì)胞富集在特定的過(guò)渡狀態(tài)，可有效地轉(zhuǎn)移到Tumor中并駐留。

TCF1+ PD-1+CD8+ T祖細(xì)胞位于Tumor淋巴網(wǎng)內(nèi)：作者又分析了淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞不同亞型占比及富集分析，淋巴細(xì)胞中Tc細(xì)胞的總數(shù)與TCF1+ PD-1+細(xì)胞的數(shù)量線(xiàn)性相關(guān)；淋巴細(xì)胞的Tc區(qū)室也主要由含有TCF1+PD-1+祖細(xì)胞的過(guò)渡T2狀態(tài)組成。免疫診療后，具有細(xì)胞毒性潛能的細(xì)胞與TCF 1+PD-1+祖細(xì)胞共定位在淋巴網(wǎng)中。之后作者推測(cè)一個(gè)模型：Tc細(xì)胞在從TCF1+S1狀態(tài)分化成T2 TCF1+PD-1+狀態(tài)時(shí)迀移到Tumor內(nèi)淋巴網(wǎng)中；ICB和Vax免疫療法促進(jìn)TCF1+PD-1+細(xì)胞在Tumor內(nèi)分化為細(xì)胞毒性S2 B狀態(tài)，然后這些細(xì)胞在抑制性受體上調(diào)和細(xì)胞毒性活性下調(diào)后進(jìn)展為T(mén)細(xì)胞耗竭S3狀態(tài)。

TCF1+ PD-1+CD8+ T祖細(xì)胞富集的淋巴網(wǎng)在早期人類(lèi)肺腺cancer中富集：作者之后又檢測(cè)了14例早期人肺腺cancer患者的樣本進(jìn)行對(duì)比。人Tumor中的淋巴網(wǎng)同小鼠類(lèi)似大多數(shù)是小的淋巴網(wǎng)，T細(xì)胞逐漸下降B細(xì)胞逐漸增加，這些發(fā)現(xiàn)表明，早期人類(lèi)和小鼠肺cancer的抗cancer免疫反應(yīng)的特征是小淋巴細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)占優(yōu)勢(shì)。Tc細(xì)胞鑒定祖CD8+ T細(xì)胞的TCF 1和PD-1共表達(dá)群體時(shí)，Tc細(xì)胞存在于淋巴網(wǎng)的外部和內(nèi)部，但TCF1+ PD-1+祖細(xì)胞主要存在與淋巴網(wǎng)，并且隨著淋巴網(wǎng)尺寸增加而增加。

03#

結(jié)論

CONCIUDE

本研究在小鼠肺cancer模型和人肺cancer中出現(xiàn)的淋巴網(wǎng)的特征進(jìn)行深入解析：淋巴網(wǎng)聚集的大小與T細(xì)胞/B細(xì)胞的數(shù)量及空間分布及發(fā)現(xiàn)TCF1+ PD-1+ CD8+T祖細(xì)胞位于Tumor內(nèi)部對(duì)淋巴細(xì)胞抗Tumor作用的全新詮釋?zhuān)愿玫慕忉屃馨途W(wǎng)產(chǎn)生支持CD8+ T細(xì)胞抗Tumor應(yīng)答的空間環(huán)境的分子機(jī)制。

摘要翻譯：

淋巴細(xì)胞是Tumor免疫監(jiān)視的關(guān)鍵，但我們對(duì)促進(jìn)淋巴細(xì)胞抗Tumor功能的空間特征了解有限。作者使用多重免疫熒光技術(shù)、定量及空間分析和機(jī)器學(xué)習(xí)創(chuàng)建了Kras/ trp53突變小鼠模型和人類(lèi)切除的肺部Tumor的高清空間特征。相互作用的淋巴細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（“淋巴網(wǎng)”）作為抗cancer免疫反應(yīng)的一個(gè)有效特征。由小T細(xì)胞聚集成簇成主要，并隨著體積的增加B細(xì)胞增加。cxcr3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的大小和數(shù)量，但T細(xì)胞抗原的表達(dá)指導(dǎo)Tumor內(nèi)定位。淋巴細(xì)胞優(yōu)先攜帶參與免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）診療應(yīng)答的TCF1+ PD-1+祖細(xì)胞CD8+ T細(xì)胞。在使用ICB或抗原靶向疫苗診療的小鼠中，淋巴細(xì)胞保留了祖細(xì)胞并獲得了細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞群，這可能是通過(guò)祖細(xì)胞分化實(shí)現(xiàn)的。這些數(shù)據(jù)表明，淋巴細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)支持CD8+ T細(xì)胞抗Tumor反應(yīng)的空間環(huán)境。